近日，青海大学高原医学研究中心马英老师团队联合陕西开放大学刘欣老师团队、第四军医大学戴太强老师团队，在美国物理联合会（AIP）老牌期刊《Applied Physics Letters》（影响因子3.8，原中科院二区）发表原创研究成果。成功攻克了活细胞线粒体长时程动态观测的核心技术瓶颈，打造出硬件与深度学习深度融合的无标记亚细胞成像新方案，为无损高内涵活细胞显微观测开辟了全新路径。

传统方法的两难：要“标记”就得“受伤”，要“无伤”就看不清：

荧光显微镜能精准点亮线粒体，但光漂白和光毒性如同“双刃剑”，照得越久，细胞伤得越重，长期观察反而可能改变线粒体的真实行为。定量相位显微成像技术则完全不用标记，对细胞几乎零干扰，但它缺乏分子特异性，无法自动区分细胞器，识别全靠经验判断。过去的主流思路是把二者结合，用深度学习将相位图“翻译”成荧光图。但传统方案依赖后期配准，光学漂移、像差、时序错位都会引入像素级偏差，影响精度；而无监督学习虽绕开配准，却常常“脑补”出错误结构，可靠性大打折扣。如何在不损伤细胞的前提下，让无标记定量相位显微成像“看懂”线粒体并实时追踪？ 这正是领域内长期悬而未决的难题。

破局之道：天然亚像素配准 + 强物理约束深度学习

团队从源头入手，通过二向色镜耦合以及空间光调制器实时相位补偿技术，搭建了共用探测光路的平场定量相衬显微/荧光显微双模态显微系统。该系统无需任何后期校正，即可直接输出亚像素级天然配准的相位-荧光图像对（水平和垂直配准误差分别仅为-0.01±0.11和0.07±0.14像素），彻底消除了传统方案中的数据“噪音”，如图1所示。

有了这份“天生一对”的训练数据，深度学习模型的压力骤减。团队选用嵌套密集跳跃连接的U-Net++网络（见图2），配合MSE与SSIM复合损失函数，能够稳定处理2048×2048全视场图像，推理速度达3.47帧/秒，无需人工剔除脂滴等干扰物，真正实现“一键式”智能识别。

图1 亚像素对准双模式显微成像原理与验证。

图2 U-Net++网络结构。

效果惊艳：精准度、鲁棒性、泛化性全面领先

在活体COS-7细胞上，对比无监督算法，U-Net++在SSIM、Pearson相关系数和Dice系数上均大幅领先（见图3）。即便在相位对比度很低的区域，依然能清晰还原线粒体纤细的网络结构，而无监督算法则频频出现误判。这充分证明，天然配准带来的物理先验比纯粹依赖数据统计更可靠。更为难得的是，训练好的模型无需任何微调，即可直接应用于四套不同的定量相位显微设备，均能稳定输出高质量线粒体图像（见图4）。这种“一训多用”的泛化能力，意味着该方案有望成为定量相位显微平台的“标准插件”。

图3 U-Net++与无监督算法对比。

图4 U-Net++跨平台验证。

真正的长时动态观测：15分钟“直播”线粒体动态

因为无需荧光激发，本系统可以在正常生理状态下持续观察细胞动态。团队对活体COS-7细胞进行了长达15分钟的连续成像，清晰捕捉到线粒体的融合、分裂以及与脂滴的亲密互作，见图5所示。同时，系统自动量化了线粒体面积、周长、长宽比和圆度等形态参数，为评估细胞代谢状态提供了可重复的客观指标。

图5 活体COS-7细胞15分钟连续成像（线粒体动态演变）。

深耕高原医学：为低氧应激研究提供全新“可视化”利器

本技术将为高原医学研究提供非侵入式的全新研究工具，具有独特的科研价值与转化前景。线粒体是细胞氧感知与能量代谢的核心枢纽。高原低氧环境会显著扰动线粒体功能与脂滴动态平衡，这一过程被认为是高原病发生发展的核心细胞机制之一。然而，传统成像手段难以在无损、长时程条件下追踪细胞器在低氧暴露及药物干预中的动态响应，制约了相关机制的深入解析。本技术恰好弥补了这一空白。在无标记、无损伤、长时程成像条件下，团队将对高原低氧暴露及药物干预过程中的线粒体、脂滴、核仁等关键细胞器进行连续追踪，直接定量评估其形态重塑与互作动态。这为解析高原低氧应激损伤机制、筛选高原病防护药物、评价干预疗效，提供了高精度、可视化、定量化的全新支撑手段。本技术的落地，有望从亚细胞层面拓展高原医学研究的技术边界与观测维度，推动高原医学研究向更深层次迈进。

前景广阔：让无标记高内涵成像成为实验室标配

这项研究首次将天然亚像素配准的双模成像与强物理约束深度学习有机结合，从根本上简化了网络的学习任务，使模型在低对比度、大视场、动态复杂场景下依然保持高置信度。它彻底摆脱了荧光标记的束缚，简化了数据制备流程，标准化了识别过程，可广泛应用于高通量药物筛选、长时程活细胞观测、细胞代谢与病理机制研究等领域。

本次成果是多团队医工交叉、协同创新的生动体现。特别值得一提的是，青海大学医学院本科生薛海馨深度参与本工作并担任共同第一作者，彰显了学校在本科生科研培养上的扎实成效。未来，团队将继续聚焦无损高分辨显微成像核心技术，推动前沿成果落地转化，为生命科学基础探索与精准医疗提供先进工具。

论文信息

· 标题：Subpixel-Registered Dual-Mode Imaging Enables Label-Free Inference of Mitochondria in Living Cells

· 期刊：Applied Physics Letters（影响因子3.8，中科院二区）

· 作者：Ying Ma, Haixin Xue, Taiqiang Dai, Xin Liu, Qilong Tan, Zhanqiang Li, Lan Ma

· DOI： https://doi.org/10.1063/5.0338419